SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3979—2014 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定方法 杯碟法 Determination of penicillinase in milk and dairy products- Cylinder plate method 2014-07-14发布 2015-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3979—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中 心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、西南大学。 本标准主要起草人：李应国、薛晓晶、李玲、金涌、周庆、聂福平、肖进文、田世民、李贤良、王国民、 田晋红、龙再浩。 I SN/T 3979--2014 4.13抗生素检定培养Ⅱ号（低pH)：按A.8配制。 4.140.2μm滤膜。 5仪器和设备 5.1天平（感量0.0001g）。 5.2微型振荡器。 5.3恒温培养箱：(36±1)℃。 5.4 高压灭菌器。 5.5 5麦氏比浊仪或标准比浊管。 5.6 pH计。 5.7 测量尺（精度0.1mm)或相同作用的检测仪（精度0.02mm）。 5.8 3无菌培养Ⅲ：内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。 5.9 9无菌牛津杯：外径（8.0士0.1)mm，内径（6.0士0.1)mm，高度（10.0±0.1)mm。 5.10 无菌吸管：1mL(0.01mL刻度值），10mL(0.1mL刻度值）。 5.11 6操作步骤 6.1 菌悬液的制备 将藤黄微球菌划线接种于营养琼脂平板上，经（36士1)℃培养24h～36h至长出单菌落，4℃保存， 存贮期限28d。 悬液浓度，终浓度应为1×10°CFU/mL～1X10°CFU/mL，可供5d内使用。 6.2 2检测用平板的制备 菌悬液按1：20加入到无菌的大约50℃抗生素检定培养基Ⅱ号中，充分摇匀。取90mm无菌培 养皿，加入（15土1)mL含菌的抗生素检定培养基Ⅱ号，凝固后在其表面放置4个无菌牛津杯，备用 6.3 样品的制备 将待检样品充分混匀，取1mL待检样品置于1.5mL离心管中，共4管，分别标为：A、B、C、D，每个 样品做三个平行，共12管。如样品为生鲜乳或纯牛奶，则直接进行实验；如样品为乳粉，则用水将乳粉 按1：10的比例稀释后，进行实验；如样品为较稠乳制品，应用水将样品按1：1的比例稀释后，进行实 验；如样品为酸性乳制品，应用NaOH调节pH值至6～7后，进行实验。 同时，每次检测应做阳性质控对照和阴性对照。阳性质控对照样品为灭菌后并经检测为阴性的脱 脂奶或牛体乳，添加β-内酰胺酶标准品至终浓度为0.5U/L。阴性对照样品为灭菌后的阴性脱脂奶或 牛体乳。制备操作同待检样品。 6.4样品的测定 按照下列顺序（见表1)分别将青霉素G标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到样 品及阳性/阴性对照样品中： 2 SN/T 3979—2014 表 1 离心管编号 青霉素G 舒巴坦 β-内酰胺酶 A 5 μL B 5 μL 25 μL c 5 μL 25 μL D 5 μL 25 μL 25 μL 混匀后，将上述A～D试样各取200μL加人放置于检测用平板上的4个无菌牛津杯中，（36土1)℃ 培养18h～22h，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。 7结果判定 7.1对照组 7.1.1阴性对照组：A、B、D产生抑菌圈，且A、B抑菌圈直径差异<3mm，三次平行实验结果一致；C 抑菌圈直径小于D抑菌圈，且抑菌圈直径差异≥3mm，三次平行实验结果一致。 7.1.2阳性添加对照组：B、D产生抑菌圈，且A抑菌圈直径小于B抑菌圈直径，差异≥3mm，三次平行 实验结果一致；C抑菌圈直径小于D抑菌圈，且抑菌圈直径差异≥3mm，三次平行实验结果一致。 7.2 样品组 7.2.1当B、D产生抑菌圈，且C抑菌圈直径小于D抑菌圈，抑菌圈直径差异≥3mm，三次平行实验结 果一致时，进行如下判定： A抑菌圈直径小于B抑菌圈直径，差异≥3mm，三次平行实验结果一致，则判定该样品检出β- a) 内酰胺酶，报告β-内酰胺酶检测结果为阳性。 b） 若A、B抑菌圈差异<3mm，三次平行实验结果一致，则判定该样品未检出3-内酰胺酶，报告 β-内酰胺酶检测结果为阴性。 7.2.2当样品A不产生抑菌圈且B产生的抑菌圈<11mm或A、B均不产生抑菌圈，应将样品稀释 10倍，再按照本方法（见第6章操作步骤）进行检测。 8检测限 以青霉素G为底物，本方法的检测限为0.5U/L。 3 SN/T3979—2014 附录A （规范性附录） 培养基及试剂的配制 A.10.1mol/LTris-HCI-BSA溶液(pH7.0) Tris 碱 12.1 g BSA 1.0 g 去离子水 1000.0mL 用盐酸调pH至7.0。 A.2 2磷酸盐缓冲溶液（pH6.0） 无水磷酸二氢钾 8.0 g 无水磷酸氢二钾 2.0 g 去离子水 1000.0ml 121℃高压灭菌15min，备用。 A.3 青霉素G标准溶液 称取10.0mg青霉素G标准品，精确到0.0001g，用A.2溶液定容至100.0mL，浓度为0.1mg/mL的 溶液，4℃可保存14d，分装后一20℃可保存180d，不可反复冻融使用。 A.4 4β-内酰胺酶(sigma)标准溶液 用0.1mol/LTris-HCl溶液（pH7.0，含0.1%BSA)溶液1mL溶解1KUβ-内酰胺酶标准品，配制 成浓度为1KU/mLβ-内酰胺酶标准溶液，用Tris-HCI缓冲溶液溶解并定容为4U/mL的溶液。用 0.2μm滤膜过滤，4℃保存21d，分装后一20℃可保存（540士180)d，不可反复冻融使用。解冻使用前， 用阴性脱脂奶液将β-内酰胺酶标准储存液稀释为0.02U/mL的工作母液， A.5 舒巴坦（USP)标准溶液 称取100mg舒巴坦，用A.2溶液定容到50mL，浓度为2mg/mL。分装后一20℃保存备用，保存 期为（540士180)d，不可反复冻融使用。 A.6 营养琼脂 蛋白陈 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 5.0 g 氯化钠 琼脂 15.0g~20.0g 去离子水 1000.0mL 4 SN/T 3979—2014 混匀，121℃高压灭菌15min。 A.7 脑心浸液培养基 蛋白陈 10.0 g 牛脑浸粉 12.5 g 2.0 g 葡萄糖 牛心浸粉 5.0 g 5.0 g 氯化钠 磷酸氢二钠 2.5 g 去离子水 1000.0mL pH 7.4±0.1 混匀，121℃高压灭菌15min。 A.8 抗生素检定培养基Ⅱ号 蛋白陈 6.0 g 牛肉粉 1.5 g 酵母粉 6.0 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 13.0 g 去离子水 1000.0 mL pH 6.5~6.6 混匀，121℃高压灭菌15min。 5