ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国国家标准 GB/T18653—2025 代替GB/T18653—2002 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 MethodsfortheisolationandidentificationofCampylobacterfetus 2025-08-29发布 2026-03-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅳ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 缩略语 1 …………………………………………………………………………………………………… 5 仪器设备 1 ………………………………………………………………………………………………… 6 试剂和材料 2 ……………………………………………………………………………………………… 7 生物安全措施 3 …………………………………………………………………………………………… 8 检验程序 3 ………………………………………………………………………………………………… 9 样品采集与运输 4 ………………………………………………………………………………………… 10 样品分离与纯化 5 ………………………………………………………………………………………… 11 生化鉴定 6 ………………………………………………………………………………………………… 12 PCR鉴定 7 ……………………………………………………………………………………………… 13 实时荧光PCR鉴定 9 …………………………………………………………………………………… 14 质谱鉴定 10 ……………………………………………………………………………………………… 15 综合判定 10 ……………………………………………………………………………………………… 附录A(规范性) 培养基和试剂的配制 11 ………………………………………………………………… 附录B(资料性) 胎儿弯曲杆菌菌落形态示意图 15 ……………………………………………………… 附录C(资料性) 胎儿弯曲杆菌PCR产物大小和测序结果对照 16 …………………………………… 附录D(资料性) 胎儿弯曲杆菌实时荧光PCR扩增曲线 17 …………………………………………… 附录E(资料性) 微生物质谱仪鉴定谱图 18 ……………………………………………………………… ⅠGB/T18653—2025 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T18653—2002《胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法》,与GB/T18653—2002相比,除 结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———更改了范围(见第1章,2002年版的第1章); ———增加了缩略语(见第4章); ———更改了仪器设备、试剂和材料(见第5章和第6章,2002年版的2.1,2.2); ———增加了生物安全措施(见第7章); ———更改了检验程序(见第8章,2002年版的2.4,2.5); ———增加了PCR鉴定方法(见第12章); ———增加了实时荧光PCR鉴定方法(见第13章); ———增加了质谱鉴定方法(见第14章); ———更改了培养基和试剂及其配制方法(见附录A,2002年版的附录A)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本文件起草单位:南京农业大学、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、中国动物卫生与流行 病学中心、中国药科大学、青岛海洋科技馆。 本文件主要起草人:薛峰、申进玲、李超、曲志娜、曹钰莹、戴建君、汤芳、任建鸾、王玉英、王娟、王琳。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2002年首次发布为GB/T18653—2002; ———本次为第一次修订。 ⅢGB/T18653—2025 引 言 胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)为革兰阴性杆菌,呈S型、海鸥飞行轮廓型和螺旋状弯曲,无 芽孢和荚膜,为微需氧菌,在严格厌氧条件下微弱生长或不生长。胎儿弯曲杆菌分为3个亚种,分别为 胎儿弯曲杆菌胎儿亚种(Campylobacterfetussubsp.fetus)、胎儿弯曲杆菌性病亚种(Campylobacter fetussubsp.venerealis)、胎儿弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacterfetussubsp.testudinum)。牛、羊感 染胎儿弯曲杆菌胎儿亚种多会引发散发性流产,牛感染胎儿弯曲杆菌性病亚种会导致不育、胚胎早死和 流产,造成严重经济损失。人类偶有胎儿弯曲杆菌胎儿亚种感染,一般见于孕妇或免疫低下的个体,依 据感染部位不同常导致多种并发症。 ⅣGB/T18653—2025 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 1 范围 本文件描述了胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)的分离鉴定方法。 本文件适用于公畜包皮垢及精液、母畜阴道黏液、流产胎盘及胎儿的肝、肺和胃内容物等样品中胎 儿弯曲杆菌的分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用本 文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值:循环阈值(CycleThresholdValue) DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) rRNA:核糖体核糖核酸(RibosomalRibonucleicAcid) PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) TEM:增菌运输培养基(TransportEnrichmentMedium) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSolution) 5 仪器设备 5.1 荧光定量PCR仪。 5.2 PCR仪。 5.3 DNA凝胶电泳设备。 5.4 高速冷冻离心机(可控温至4℃、离心速度可达12000g以上)。 5.5 高压灭菌器。 5.6 天平(感量0.01g,感量0.0001g)。 5.7 冰箱(2℃~8℃、-20℃或以下)。 5.8 涡旋混合器。 1GB/T18653—2025 5.9 微量移液器(0.2μL~2μL、1μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL,并 配备与移液器匹配的吸头)。 5.10 Ⅱ级生物安全柜。 5.11 微需氧培养装置(提供微需氧条件:5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气)。 5.12 显微镜:目镜10×,物镜10×~100×。 5.13 微生物生化鉴定系统。 5.14 分光光度计或核酸蛋白测定仪。 5.15 麦氏比浊仪。 5.16 电泳凝胶成像分析系统。 5.17 微生物质谱仪(MALDI-TOFMS)。 5.18 水浴装置:37℃±1℃、100℃。 5.19 恒温培养箱。 5.20 人工授精(AI)吸管或卡苏吸管。 5.21 2mL灭菌注射器,5号针头,20号针头。 5.22 无菌离心管。 6 试剂和材料 6.1 要求 除非另有规定,所用试剂应为分析纯,分子生物学试验用水应符合GB/T6682规定的一级水,其他 试验用水应符合GB/T6682规定的二级水。 6.2 试剂及培养基 6.2.1 5%来苏尔:按照附录A中A.1配制。 6.2.2 无菌PBS:按照A.2配制。 6.2.3 增菌运输培养基(TEM):按照A.3配制。 6.2.4 Skirrow血琼脂:按照A.4配制。 6.2.5 哥伦比亚血琼脂:按照A.5配制。 6.2.6 布氏肉汤基础培养基:按照A.6配制。 6.2.7 氧化酶溶液:按照A.7配制。 6.2.8 3%过氧化氢溶液:按照A.8配制。 6.2.9 巯基乙酸盐肉汤:按照A.9配制。 6.2.10 马尿酸钠水解试剂:按照A.10配制。 6.2.11 革兰染色液。 6.2.12 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。 6.2.13 琼脂糖。 6.2.14 50×TAE电泳缓冲液。 6.2.15 实时荧光PCR预混液。 6.2.16 α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA):色谱纯。 6.2.17 基质溶液:取α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA),按说明书配制,或用市售商品。 6.2.18 靶板/标本板。 6.2.19 细菌DNA提取试剂盒(商品化)。 2GB/T18653—2025