ICS 65.120 CCS B 46 团 体 标 准 微生物饲料添加剂中丁酸梭菌的测定 Determination of Clostridium butyricum in microbial feed additives 2025-8-1发布 2025-9-1实施 中国饲料工业协会 发 布 T/CFIAS 6019—2025 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6019—2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国饲料工业协会团体标准技术委员会提出并归口。 本文件起草单位： 上海市兽药饲料检测所、 江苏远山生物技术有限公司、 安徽省畜牧技术推广总站、 安徽省农业科学院农业工程研究所。 本文件主要起草人：姜芹、张妤、黄士新、张莉、孙冰清、张亦菲、商军、张文刚、曹莹、顾欣、 吴雨珊、胡浩、柴虹、刘祚军、卢亚洲、尹强、李瑞、李娟、方雅红。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6019—2025 1 微生物饲料添加剂中丁酸梭菌的测定 1 范围 本文件描述了微生物饲料添加剂中丁酸梭菌的计数和鉴定的方法。 本文件适用于微生物饲料添加剂中丁酸梭菌的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂或材料 4.1 水：GB/T 6682 ，三级。 4.2 灭菌生理盐水：按照附 录A中A.1的规定执行。 4.3 标准菌株：丁酸梭菌（ Clostridium butyricum ）。 4.4 亚硫酸铁培养基：按照附录 A中A.2的规定执行。 4.5 强化梭菌培养基：按照附录 A中A.3的规定执行。 4.6 革兰氏染色液：按照附录 A中A.4的规定执行。 4.7 细菌生化鉴定商品化试剂。 4.8 10×PCR反应液。 4.9 脱氧核糖核苷三磷酸（ dNTPs）混合液：含脱氧腺苷三磷酸（ dATP）、脱氧胸苷三磷酸（ dTTP）、 脱氧鸟苷三磷酸（ dGTP）和脱氧胞苷三磷酸（ dCTP）各2.5 mmol/L。 4.10 Taq DNA聚合酶： 5 U/μL。 5 仪器设备 5.1 天平：精度为 0.01 g。 5.2 拍击式均质器或振荡器。 5.3 厌氧罐： 2.5 L或5 L（配厌氧产气袋）或相当性能的厌氧装置。 5.4 恒温培养箱： 36 ℃±1 ℃。 5.5 显微镜： 40×～1 000×。 5.6 离心机： 转速不低于 10 000 r/min 。 5.7 微量移液器： 2.5 µL，10 µL，100 µL，1 000 µL 。 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6019—2025 2 5.8 无菌培养皿：直径为 90 mm。 5.9 PCR扩增仪或荧光定量 PCR仪。 6 样品 实验室收到样品后，应采取必要措施防止样品中微生物数量的变化，并尽快测定。 7 试验步骤 7.1 活菌计数 7.1.1 试样稀释 无菌条件下称取试样 25 g（或量取 25 mL），加入装有 225 mL灭菌生理盐水的无菌均质袋或无菌锥 形瓶中，均质拍打 2 min～3 min或200 r/min 振荡 30 min，制成 1:10稀释液。用无菌吸管或微量移液器移取 上述稀释液 1 mL，注入 9 mL灭菌生理盐水中，充分混匀，制成 1:100稀释液。按上述操作方法，制备 10 倍递增系列稀释液，每递增稀释一次换用 1次1 mL无菌吸管或吸头。 7.1.2 接种培养 选择3个适宜稀释度，用无菌吸管或微量移液器移取 0.1 mL稀释液加至干燥后的亚硫酸铁培养基平 板表面，用灭菌涂布棒将稀释液均匀涂于表面。每个稀释度涂布两个平板，同时吸取 0.1 mL灭菌生理盐 水作空白对照。待稀释液吸收后，再倾注 5 mL～7 mL冷却至45 ℃～50 ℃的亚硫酸铁培养基，均匀覆盖 在平板表面，凝固后倒置， 36 ℃±1 ℃厌氧培养 18 h±2 h。 7.1.3 菌落计数 亚硫酸铁培养基中，典型的丁酸梭菌菌落呈圆形，中心为黑色实心。选择菌落数在 30个～300个之 间的平板进行计数。 7.2 形态观察与鉴定 7.2.1 菌落挑选和纯培养 随机挑选亚硫酸铁培养基平板上 3个或以上典型菌落分别划线接种于强化梭菌培养基平板上， 倒置， 36 ℃±1 ℃厌氧培养 18 h±2 h 。 7.2.2 形态观察 强化梭菌培养基上，典型的丁酸梭菌菌落呈乳白色至浅黄色，圆形或不规则，稍凸，直径约 1 mm～ 6 mm。 挑取典型菌落进行革兰氏染色。丁酸梭菌为革兰氏阳性菌，大小（ 0.6 µ m～1.2 µ m）×（3.0 µ m～7.0 µm），直杆状，端圆，单个、成对、短链、偶呈长丝状。孢子卵圆，偏心或次端生，无孢子外壁和附属 丝。 7.2.3 菌株鉴定 丁酸梭菌生理生化特征和分子生物学鉴定按照附录 B执行。若菌株形态符合 7.2.2的描述，且符合附 录B.1的生理生化特征或附录 B.2的分子生物学鉴定结果，可确认为丁酸梭菌。 8 结果与报告 8.1 菌落总数的计算 根据菌落计数结果和证实为丁酸梭菌的菌落数，计算出样品中的丁酸梭菌数，以 A计，单位为菌落 形成单位每克或每毫升（ CFU/g或CFU/mL），按式（ 1）计算： 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6019—2025 3 𝐴=𝐵×𝐶×𝑓 𝑁 ································ ································ ············ (1) 式中： 𝐵 ——丁酸梭菌疑似菌落数，单位为菌落形成单位（ CFU）； 𝐶 ——确认为丁酸梭菌的菌落数，单位为菌落形成单位（ CFU）； 𝑁 ——选出的丁酸梭菌疑似菌落数，单位为菌落形成单位（ CFU）； 𝑓 ——稀释度，单位为每克或每毫升（ /g或/mL）。 8.2 报告 计算结果保留 2位有效数字，用 10的指数形式表示。 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6019—2025 4 附录 A （规范性） 试剂和培养基 试剂和培养基按照 A.1～A.4配制或用商品化产品。 A.1 灭菌生理盐水 A.1.1 成分 氯化钠 8.5 g 水 1000 mL A.1.2 制法 取氯化钠完全溶于水中，在 121 ℃灭菌 15 min。 A.2 硫酸亚铁培养基 A.2.1 成分 胰蛋白胨 15.0 g 大豆蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 偏重亚硫酸钠 1.0 g 柠檬酸铁铵 1.0 g 琼脂 20.0 g 水 1 000 mL A.2.2 制法 除琼脂外，取上述成分混匀，微温溶解，调节 pH使灭菌后在 25 ℃的pH值为 7.6± 0.1，加入琼脂，加 热溶化，在 121 ℃灭菌 15 min。 A.3 强化梭菌培养基 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 10.0 g 酵母粉 3.0 g 葡萄糖 5.0 g 可溶性淀粉 1.0 g 氯化钠 5.0 g 醋酸钠 3.0 g L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g 琼脂 15.0 g 水 1 000 mL A.3.2 制法 除琼脂外，取上述成分混匀，微温溶解，调节 pH使灭菌后在 25 ℃的pH