ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 289—2025 抗猪SIgA单克隆抗体的制备及纯化操作 规程 Operating procdures for preparation and purification of monoclonal antibody against procine SIgA 2025 - 9 - 30发布 2025 - 9 - 30实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 289—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国兽医协会 提出并归口。 本文件起草单位： 兆丰华生物科技（福州）有限公司、兆丰华生物科技（南京）有限公司 。 本文件主要起草人： 朱海侠、潘小慧、傅星源、韩璐霖、胡晓涵、张丽萍、陈雷、吴润生、包松英。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 289—2025 II 引 言 分泌型免疫球蛋白 A（Secretory immunoglobulin A ，SIgA）是参与黏膜免疫反应的主要效应因子， 是机体免疫系统中的重要组成部分，在黏膜免疫中发挥着重要作用。 SIgA是由 2个单体 IgA、J链和分泌片（ SC）组成。 SC由黏膜上皮细胞和外分泌腺产生，是 SIgA 的特有成分，是区分 IgA和SIgA的标志。当前， SIgA的检测在动物疫病（如：猪流行性腹泻、猪气喘 病、鸡新城疫、传染性法氏囊、鸭瘟等）的早期诊断和疫苗使用效果评估上都具有较大的应用价值。但 是国内缺乏针对 SIgA的检测试剂，且采用直接提取的方式获得的 SIgA在纯度和含量上均难以满足临 床需求，本文件针对猪源 SIgA的特有成分 SC基因进行原核表达载体的构建，通过 pET32a -SC蛋白的 表达、纯化、细胞融合技术及免疫荧光技术等的应用，获得抗猪 SIgA单克隆抗体。通过抗猪 SIgA抗 体浓度的标定，可以实现对动物乳汁和鼻腔粘液等样本中 SIgA含量的测定。也可以通过 HRP标记、 FITC标记等实现待检样品中 SIgA的定性分析， 以满足临床上猪常见的呼吸道、 胃肠道类疫病的诊断及 应用。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 289—2025 1 抗猪SIgA单克隆抗体的制备及纯化操作规程 1 范围 本文件规定了利用 BALB/c雌性小鼠（ SPF级）进行抗猪 SIgA单克隆抗体的制备、纯化的要求。 本文件适用于抗猪 SIgA单克隆抗体的制备及纯化。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 1 4925 实验动物 环境及设施 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 35892 实验动物 福利伦理审查指南 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 抗SIgA抗体：抗猪 SIgA单克隆抗体（ Monoclonal antibody against porcine SIgA ） SIgA：分泌型免疫球蛋白 A（Secretory immunoglobulin A ） SPF：无特定病原（ Special pathogen free ，SPF） 5 主要试验材料 5.1 实验动物 BALB/c雌性小鼠，SPF级， 6 ~ 8周龄。 5.2 试剂与耗材 5.2.1 抗原。 pET32a -SC重组蛋白，制备方法见附录 A。 5.2.2 佐剂（弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂）。 5.2.3 细胞（ Sp2/0、Sf 9）。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 289—2025 2 5.2.4 离心管（ 1.5 mL，无菌） 。 5.2.5 微量移液器吸头 （10 μL、200 μL、1000 μL，无菌） 。 5.2.6 血清稀释板（ 96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培养板）。 5.2.7 一次性注射器或采血管（ 5 mL、10 mL）。 5.2.8 细胞培养板（ 6孔、24孔、 48孔、 96孔，无菌） 。 5.2.9 细胞计数板。 5.2.10 台盼蓝（ 0.4 %）。 5.2.11 细胞筛（ 200目）。 5.2.12 细胞培养基（ DMEM、HAT、HT）。 5.2.13 胎牛血清。 5.2.14 聚乙二醇（ PEG1450 ）。 5.2.15 重组杆状病毒 SC（制备方法见附录 E）。 5.2.16 一次性移液管（ 5 mL、10 mL，无菌）。 5.2.17 96孔ELISA微孔板。 5.2.18 标记抗体（ IgG-HRP、IgA-HRP、IgG-FITC）。 5.2.19 标签抗体（ Anti-His）。 5.2.20 显色液（ TMB、AEC）。 5.2.21 Protein G 亲和层析柱。 5.2.22 除菌滤器（ 0.22 μm）。 5.2.23 超滤管（ 10 kDa）。 6 仪器设备 6.1 冰箱： 2 ℃ ~ 8℃ ，-20 ℃以下。 6.2 低速离心机。 6.3 培养箱（恒温培养箱、 CO 2培养箱、生化培养箱）。 6.4 恒温振荡摇床。 6.5 酶标仪。 6.6 倒置显微镜。 6.7 荧光显微镜。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 289—2025 3 6.8 微量移液器（量程为 2 µ L ~ 20 µ L 、20 µ L ~ 200 µ L 和200 µ L ~ 1000 µ L ）。 6.9 多道移液器（量程为 30 µ L ~ 300 µ L ）。 6.10 蛋白纯化仪。 6.11 超声破碎仪。 7 抗SIgA抗体的制备 7.1 动物免疫 7.1.1 首次免疫 ：将抗原与弗氏完全佐剂按照 1:1 ~ 1:1.1体积比进行乳化， 2 ~ 8 ℃静置 16 ~ 18 h， 未出现分层后，皮下多点注射， 50 ~ 100 μg/ 只。 7.1.2 二次免疫 ：间隔 10 ~ 15 d，相同抗原进行加强免疫， 60 ~ 120 μg/ 只，皮下多点注射。 7.1.3 三次免疫 ：间隔 10 ~ 15 d 后，眼眶采集小鼠血液， 4 ℃静置过夜， 600 g离心 10 min，分离血 清，采用间接 ELISA方法进行抗体滴度测定（检测方法见附录 B）。当抗体滴度小于 105时，继续加 强免疫，当抗体滴度大于 105时，融合前 2 ~ 3 d腹腔注射抗原， 100 μg/只。 7.2 B细胞的制备 7.2.1 取上述免疫合格的小鼠，消毒处理后，无菌采集脾脏组织，对脾脏用不含血清的 DMEM液体 培养基（以下简称 “不完全培养基 ”）进行简单润洗后，用一次性注射器内芯进行反复按压至脾完全 破碎。 7.2.2 无菌吸取上述处理好的脾细胞，用 200目的细胞筛进行过滤处理。 7.2.3 将过滤后的细胞进行洗涤， 150 g离心 10 min，重复 2 ~ 3 次后，细胞计数。 7.3 小鼠骨髓瘤 Sp2/0细胞的处理 将长满单层的小鼠骨髓瘤 Sp2/0细胞轻轻吹打下来，用不完全培养基洗涤 3次后，采用细胞计数和 台盼蓝染色方法对细胞数量和活率进行测定，要求细胞数量达 107 个/mL，活率 98 %以上。 7.4 杂交瘤细胞的制备 7.4.1 将上述处理好的 B细胞和小鼠骨髓瘤 Sp2/0细胞按照 4:1 ~ 5:1 的数量比例混匀后， 150 g离心 10 min，弃去上清，将细胞沉淀轻轻弹松散，置 37 ℃预温的水杯中， 1 min内加入 0.8 ~ 1 mL 的聚乙 二醇（ 50 % PEG1450 ），静置 90 s。 7.4.2 加入 37 ℃预热的不完全培养基进行终止，前 1 min内加入 4 mL，并不断摇匀，后 1 min内继 续加入 2 ~ 3倍体积（ 8 ~ 12 mL ）的不完全培养基，最后补充 2 ~ 3倍体积（ 24 ~ 48 mL ）的不完全培 养基以便完全终止反应。 7.4.3 终止结束后， 150 g离心 10 min，小心弃去上清，将细胞沉淀用含 15 %胎牛血清的 HAT培养 基进行重悬，加入到提前铺有饲养细胞（见附录 C）的 96孔细胞培养板中， 100 μL/孔， 37 ℃ 5 % CO 2培养箱培养，于 7 ~ 10 d后采用半量换液法进行 HT培养基的替换，同时补加饲养细胞（ 1 ~ 2× 104 个/孔），观察细胞生长情况，并对单个或多个细胞簇分别进行标记。 中国兽医协会 CVMA 全