ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 291—2025 鉴别免疫与感染动物的布鲁氏菌天然半抗 原抗体琼脂扩散试验 The Protocol of detecting the antibodies of Brucella native hapten by argar gel immunodiffusion test（AGID）for discriminating infected animals from vaccinated animals 2025 - 9 - 30发布 2025 - 9 - 30实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 291—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国动物卫生与流行病学中心 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 中国动物卫生与流行病学中心、青岛市动物疫病预防控制中心、新疆生产建设兵 团第十二师畜牧水产发展服务中心、青岛立见生物技术有限公司、 包头市动物疫病预防控制中心、 内蒙 古包头市固阳县畜牧技术服务中心。 本文件主要起草人： 邵卫星、李彦、焉鑫、段笑笑、赵明、孙荣钊、徐晶晶、孙世雄、张培培、张 研博、亓菲、 杜建军、 王东云、马帅、孙明军、张皓博、刘蒙达、靳继惠、黄孟锟、孙翔翔。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 291—2025 II 引 言 布鲁氏菌病（ Brucellosis ）是我国当前最重要的人兽共患病之一。由于动物接种布鲁氏菌疫苗可严 重干扰布鲁氏菌病的流行病学监测及诊断，因此，需要一种简单、快速、可有效区分疫苗免疫和感染动 物的抗体检测方法。光滑型布鲁氏菌的天然半抗原（ Native Hapten ，NH）是一种分子量小、抗原性较 弱的抗原，感染动物与免疫动物诱导的 NH抗体不同，主要体现在：野生型布鲁氏菌感染动物后，可持 续刺激机体产生针对 NH的抗体，持续时间长，且抗体与 NH抗原结合常数相对高；而接种动物后，疫 苗株可被机体快速清除， 不能持续刺激机体产生 NH抗体， 持续时间短， 且抗体与抗原结合常数相对低。 依据 NH抗体在感染和免疫动物体内抗体的滴度、持续时间及与 NH抗原结合常数的不同，可通过检测 NH抗体来鉴别免疫动物和感染动物。 本文件仅规定了牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌两种光滑型布鲁氏菌感染牛、羊引起的 NH抗体琼脂 扩散检测方法的技术内容。 本文件等同采用 WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》中 3.1.4章“布鲁氏菌病（牛种、羊种和 猪种布鲁氏菌感染）（ 2022版）”的 8.9节内容。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 291—2025 1 鉴别免疫与感染动物的布鲁氏菌天然半抗原抗体琼脂扩散试验 1 范围 本文件规定了检测牛、羊血清中布鲁氏菌天然半抗原（ NH）抗体琼脂扩散试验方法（ AGID）的程 序。 本文件适用于检测布鲁氏菌疫苗免疫背景清晰、且虎红 平板凝集试验结果为阳性的牛、羊。在适当 时机检测，其阳性结果可作为已感染牛、 羊且在体内处于感染活跃期布鲁氏菌的指征或布鲁氏菌正在经 阴道 /或乳汁、精液向体外排出的指征。 本文件不适用于接种粗糙型疫苗牛、羊的检测；本文件阴性结果不适用于判定牛、羊没有感染布鲁 氏菌。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 感染活跃期 active stage 病原菌感染易感动物，且在易感动物体内处于增殖状态的阶段。如布鲁氏菌感染牛、羊等 易感动物 后且进入感染活跃期，感染动物常出现菌血症，并通过机体向外排菌的情况（其血液、乳汁、阴道分泌 物、精液等可分离检测到布鲁氏菌）。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AGID：琼脂凝胶免疫扩散试验（ Agar gel immunodiffusion test ） NH：天然半抗原（ Native hapten ） 5 试剂和耗材 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 291—2025 2 5.1 试剂与耗材 5.1.1 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 中二级水的要求。 5.1.2 布鲁氏菌天然半抗原，制备方法见附录 A。 5.1.3 带梅花形孔的琼脂糖平板，制备方法见附录 B。 5.1.4 阴性对照血清为布鲁氏菌疫苗免疫血清，制备方法见附录 C。 5.1.5 阳性对照血清为布鲁氏菌感染血清，制备方法见附录 D。 5.1.6 离心管（ 2.0 mL，无核酸酶） 。 5.1.7 微量移液器吸头 （10 μL、200 μL，无核酸酶） 。 6 仪器设备 6.1 冰箱： 2 ℃ ~ 8℃，-20 ℃以下。 6.2 密闭湿盒。 6.3 恒温培养箱。 6.4 酒精灯。 6.5 微量移液器 （量程为 2 µL ~ 20 µ L、20 µ L ~ 200 µ L）。 7 样品制备 牛、羊血液样品采集与处理按照 NY/T 541执行，且血清经虎红平板凝集试验检测为阳性。 8 检测时机的选择 8.1 对于仅在未成年免疫一次疫苗的牛、羊 8.1.1 对于未成年羊（ 3月龄 ~ 4月龄） 口服或皮下注射 S2疫苗，可在免疫后 2个月开始检测。 皮下注射 M5、M5-90、M5-90Δbp26或BA0711 疫苗，可在免疫后 4个月开始检测。点眼接种 Rev I疫苗，可在免疫后 2个月开始检测。 8.1.2 对于未成年牛（ 3月龄 ~ 8 月龄） 口服 S2疫苗，可在免疫后 2个月开始检测。皮下注射 A19、A19ΔvirB12 、S19或BA0711疫苗，可在 免疫后 4个月开始检测。 8.2 对于成年（性成熟）后仅免疫一次疫苗的牛、羊 8.2.1 对于成年羊 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 291—2025 3 口服 S2疫苗，可在免疫后 2个月开始检测。皮下注射 M5-90、M5-90Δbp26或BA0711疫苗，可在免 疫后 4个月开始检测。点眼接种 Rev I疫苗，可在免疫后 2个月开始检测。无论何种疫苗免疫，都可在分 娩1个月后进行检测。 8.2.2 对于成年牛 皮下注射 A19、A19ΔvirB12、S19或BA0711疫苗， 可在免疫后 4个月开始检测。 无论何种疫苗免疫， 都可在分娩 1个月后进行检测。 8.3 对于成年（性成熟）后免疫二次（间隔 1年以上）的牛、羊 皮下二次接种 A19、A19ΔvirB12、S19或BA0711疫苗，可在免疫后 9个月开始检测，或在分娩（二 免后）后 1个月进行检测。 8.4 对于成年后频繁免疫或每年免疫一次的牛、羊 本方法不适用该类牛、羊的检测。 9 试验程序 9.1 从2 ℃ ~ 8 ℃冰箱中取出 带有梅花形 （一个梅花形包含 6个周围孔和 1个中间孔） 孔的 琼脂糖平板， 从-20 ℃冰箱中取出检测抗原、对照血清和待检血清，恢复至室温。将琼脂糖平板快速在酒精灯火苗上 反复经过 4 次 ~ 5 次（不超过 10 s），对琼脂糖平板梅花 形孔的底部进行封闭，避免加入的抗原或血清 从梅花孔底部渗漏。 9.2 向琼脂糖平板 上梅花形周围孔中加入待测血清 ，每孔加 18 μL ~ 20 μL。将等量的阴性对照血清和 阳性对照血清分别加到琼脂糖平板 上同一个梅花形周围邻近的 2个孔中（参见 1中NC孔和 PC孔）。每批 检测只需设 1孔阳性对照和 1孔阴性对照。 9.3 将18 μL ~ 20 μL的检测抗原加到琼脂糖平板每个梅花形的中央孔中（参见图 1中A孔）。 9.4 将加完血清和抗原的琼脂糖平板盖上平皿盖，放入湿盒中，密闭，在 37℃恒温培养箱中孵育 24 h ~ 96 h。 9.5 结果判定 9.5.1 沉淀线观察 在37 ℃恒温培养箱中孵育 12 h以上（最长不超过 24 h）后，取出琼脂糖平板，对着光源，并倾斜一 定的角度，观察在抗原孔和血清孔之间是否存在沉淀线。 9.5.2 试验成立条件 阳性对照血清孔 与抗原孔之间 出现 1条沉淀线 ，并靠近血清孔一侧 （参见图 1中PC孔）；而阴性对 照血清与抗原孔之间 不出现沉淀线（参见图 1中NC孔）。 9.5.3 结果判定 9.5.3.1 非结构蛋白 3ABC抗体个体阳性率在抗原孔与血清孔之间无沉淀