SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3984—2014 犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范 Quarantine protocol for canine parvovirus by real-time PCR 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3984—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、西南民族大学。 本标准主要起草人：陈世界、杨苗、林华、胡娟、杨晓农、张焕容、杨发龙、薛昌华、于学辉、牟静、王斌 黄河、余华。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 3984—2014 犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范 1范围 本标准规定了犬细小病毒实时荧光PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于易感动物犬细小病毒的检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3仪器和试剂 3.1主要仪器 3.1.1 荧光定量PCR仪。 3.1.2 高速冷冻离心机。 3.1.3 旋涡混匀器。 3.1.4恒温循环水浴槽。 3.1.5 低温冰箱。 3.1.6 可调单头微量移液器 3.2 主要试剂 试剂为分析纯或生化试剂.用于实时荧光PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有试验 用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T6682中的三级水要求。 3.2.1 动物粪便DNA提取试剂盒。 3.2.2动物血液与组织DNA提取试剂盒。 3.2.3荧光定量PCR反应预混液。 3.2.4犬细小病毒阳性质粒,DNA序列为GGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACT AACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGC。 3.2.5实时荧光PCR扩增所用的引物和探针的序列见表1。 表1引物和TaqMan探针 序列 引物和探针 长度/bp Tm值/℃ GC/% 55.9 上游引物 5'-GGCCTGGGAACAGTCTTGAC-3" 20 60.0 下游引物 5'-GCGAAGATAAGCAGCGTAAGC-3" 21 54.4 52.4 25 62.6 Taqman探针 5'-FAM-CCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTG-TAMRA-3' 60.0 1 SN/T 3984—2014 4样品的采集和保存 4.1粪便样品的采集和保存 从直肠内采集的样品以新鲜粪便为宜。少量采集时，先在每个灭菌离心管中加人1mL样品保存 液（pH=7.4的磷酸缓冲液），用灭菌的棉拭子插人肛门，转动至少3圈，从直肠深处蘸取粪便。之后立 即将拭子浸入样品保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管，贴上标签，密封低温保存。采集较多量的粪便 时，可将动物肛门周围消毒后，用带上胶手套的手伸入直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力 下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装人灭菌的容器内，密封并贴上标签。样品采集后于4℃冷 藏保存，然后立即运送实验室（夏季不超过24h，冬季不超过2d）。短时间不能送达的样品应于一20℃ 冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，并防正倾倒。送达实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（以 一70℃或以下为宜）保存，不应反复冻融 4.2病变肠组织样品的采集和保存 样品应采集增生，出血的病变小肠肠管约6cm长。已死亡的动物应尽快无菌采集（夏天不应超过 2h，冬天不超过6h）。样品组织应置于样品袋中，贴上标签，4℃冷藏保存和运输。如病料不能立即进 封固。 4.3 3其他样品的采集和保存 参考采集附录A描述的典型病变样品，采样、运输及保存技术参照SN/T2123。 5实时荧光PCR检测方法 5.1DNA提取 按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的DNA。 业标准信息服务平台 5.2对照样品 5.2.1 阳性对照 犬细小病毒阳性质粒DNA模板。 5.2.2阴性对照 用已知犬细小病毒阴性组织制备的DNA模板。 5.2.3空白对照 用等体积的水代替DNA模板。 5.3扩增反应体系 实时荧光PCR扩增反应体系见表2。 2