SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3589.5—2013 出口食品中常见鱼类及其制品 的鉴伪方法 第5部分：黄鱼成分检测 实时荧光PCR法 Identification of fish species in export food- Part 5:Detection of yellow croaker ingredient- 理信息服务平台 Real-time PCR method 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3589.5—2013 前 言 SN/T3589《出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法》共分为7部分： 第1部分：石斑鱼成分检测实时荧光PCR法； 第2部分：安康鱼成分检测实时荧光PCR法； 第3部分：鲑鱼成分检测实时荧光PCR法； 第4部分：河豚鱼成分检测实时荧光PCR法； 第5部分：黄鱼成分检测实时荧光PCR法； 第6部分：金枪鱼成分检测实时荧光PCR法； 第7部分：鳕鱼成分检测实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3589的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、辽宁大学。 本部分主要起草人：王芳、王秋雨、郑秋月、王金玲、徐君怡、齐震玉、赵昕、陈颖。 行业标准信息服务平台 SN/T3589.5—2013 出口食品中常见鱼类及其制品 的鉴伪方法 第5部分：黄鱼成分检测 实时荧光PCR法 1范围 SN/T3589的本部分规定了出口食品中黄鱼成分的实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于食品中黄鱼，包括大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）和小黄鱼（Psendosciaena polyactis）及其制品鉴伪的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 黄鱼Pseudosciaena 黄鱼分为大黄鱼和小黄鱼两种，隶属鱼纲，硬骨鱼亚纲，鲈形目，石首鱼科，黄鱼属，分别为我国四大 海洋业品种之一。大黄鱼分布于黄海南部、东海和南海，小黄鱼分布于我国黄海、渤海、东海及朝鲜西 海岸。 3.2 实时荧光PCRreal-timePCR 3.3 Ct值cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 4缩略语 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane] 1 SN/T3589.5—2013 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) Tag：水生栖热菌（Thermusaquaticu） OD：光密度值（opticaldensity） 5方法提要 提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用黄鱼品种的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR 扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品中黄鱼及其制品的鉴伪检测。 仪器和设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2离心机：离心转速≥12000r/min。 6.3 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。 6.4 冰箱:2℃~8℃，-20℃。 6.5 高压灭菌器。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.7 pH计。 6.8 天平：感量0.01g。 试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 7.1检测用引物（对）序列和探针：黄鱼成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见 表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列（5°-3"） 目的基因 内参照5'端引物 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 内参照3端引物 AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 真核生物18SrRNA基因 内参照探针 FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAA CC-TAMRA 大黄鱼5端引物 ACCTCAACTCTCTGGGTAAGG 大黄鱼3'端引物 TCAAACCCTTCGCCTTATTT 大黄鱼线粒体DNAND6基因 大黄鱼探针 FAM-TGTTGGTGGT-TAMRA 小黄鱼5端引物 ACCTCAACTCTCAGGATAAGG 小黄鱼3°端引物 TCAAATCCTTCACCTTATTT 小黄鱼线粒体DNAND6基因 小黄鱼探针 ROX-ATGTTGGTAGT-TAMRA 7.2CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris,用 10%盐酸调pH至8.0,121℃，高压灭菌20min，备用。 7.3TE缓冲液（Tris-HCl,EDTA缓冲液)：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。 2