SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3730.4—2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴成分检测 实时荧光PCR法 Identification of domestic animal ingredient in food and feed- Part 4 :Detection of donkey ingredientReal-time PCR method 业标准信息服务平台 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3730.4—2013 前言 第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法； 第2部分：狗成分检测实时荧光PCR法； 第3部分：狐狸成分检测实时荧光PCR法； 第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法； 第5部分：马成分检测实时荧光PCR法； 第6部分：猫成分检测实时荧光PCR法； 第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法； 第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3730的第4部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验 检疫科学研究院。 本部分主要起草人：宗卉、曹琛福、张彩虹、石丰运、杨俊兴、黄文胜、阮周曦、卢体康、花群义、 秦智锋。 行业标准信息服务平台 I SN/T 3730.4—2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴成分检测 实时荧光PCR法 1范围 SN/T3730的本部分规定了食品及饲料中驴成分检测的实时荧光PCR方法。 本部分适用于食品及饲料中驴成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量检测规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR realtimePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.2 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 信息服务平台 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：胶氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） ROX：6-羧基-X-罗丹明（6-carboxyl-X-Rhodamine） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) 5方法提要 样品经研磨混匀后，提取DNA，以DNA为模板，采用驴线粒体ATPase6基因特异性检测引物和 1 SN/T 3730.4—2013 探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在驴成分 6试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无 DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物（对）序列和探针 驴成分扩增引物和探针详见表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列（5"-3"） 目的基因 驴成分5端引物 F:5'-AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3' 驴线粒体 驴成分3端引物 R:5'-CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3" ATPase6基因 驴成分探针 P:5'-FAM-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-ECLIPSE-3' 6.2 试剂 6.2.1 裂解液:1% CTAB;0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0);0.7 mol/L NaCl;0.01 mol/L EDTA(pH 8.0)。 6.2.2 DNA聚合酶。 6.2.3 2X荧光PCR缓冲液。 6.2.4 硫酸镁。 6.2.5 dNTP混合液。 行业标准信息服务平台 6.2.6 ROX染料。 6.2.7 三氯甲烷。 6.2.8 异丙醇。 6.2.9 75%乙醇。 6.2.10 双蒸水。 仪器和设备 7.1 离心机（最大离心力大于12000g）。 7.2 微量移液器（100μ~1000μL，20μ200μ，2μ~20μ.0.5g 7.3 实时荧光PCR仪。 7.4 恒温水浴锅。 7.5天平：感量0.001g和0.1g。 7.6 涡旋振荡器。 7.7 pH计。 8 检验步骤 8.1 样品制备 称取待检样品200g，研磨混匀待用。 2