SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3730.6—2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第6部分：猫成分检测 实时荧光PCR法 Identification of domestic animal ingredient in food and feed- Part 6:Detection of cat ingredient- Real-time PCR method 标准信息服务平台 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3730.6—2013 前言 SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分： 第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法； 第2部分：狗成分检测实时荧光PCR法； 第3部分：狐狸成分检测实时荧光PCR法； 第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法； 第5部分：马成分检测实时荧光PCR法； 第6部分：猫成分检测实时荧光PCR法； 第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法； 第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3730的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 和国上海出人境检验检疫局、宝生物工程（大连）有限公司。 本部分主要起草人：赵昕、李晶泉、郑秋月、张浩、王秋艳、封雪、张舒亚、韩建勋。 行业标准信息服务平台 SN/T 3730.6—2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第6部分：猫成分检测 实时荧光PCR法 1范围 SN/T3730的本部分规定了食品及饲料中猫成分鉴定的实时荧光PCR法。 本部分适用于食品及饲料中猫成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR realtimePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.2 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 信息服务平台 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） 4.2 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） 4.4 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane 4.5 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) 4.6 ErTaqHS：高效热启动DNA聚合酶 4.7 OD：光密度值（opticaldensity） 5方法提要 提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用猫成分的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩 1 SN/T 3730.6—2013 增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和饲料中猫成分的鉴定。 6试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物（对）序列和探针：猫成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见 表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列（5"-3"） 目的基因 内参照5端引物 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 内参照3'端引物 AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 真核生物18SrRNA基因 内参照探针 FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-Eclipse 猫5端引物 CTGCTGTCTTACTACTTCTA 猫线粒体细胞色素氧化酶 猫3'端引物 GGTGTTTAGGTTTCGATC 亚基I(COXI)基因 猫探针 FAM-CACTTCCAGTCTTAGCAGCGG-Eclipse 6.2CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB1400mmol/LNaCl20mmol/LEDTA100mmol/LTris,用 10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。 6.3TE缓冲液(Tris-ClEDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。 6.4 蛋白酶K：20mg/μL 6.5 Tris饱和酚。 行业标准 6.6 三氯甲烷。 6.7 异戊醇。 6.8 异丙醇。 6.9 70%乙醇。 6.10 EaTagHS聚合酶。 怡息服务平台 6.11 PremixEaTaqTM（2X）：EαTaqHS聚合酶（终浓度0.1U/μL）、dNTP（终浓度0.6mmol/L）、 Mg2+（终浓度6mmol/L)。 7 仪器和设备 7.1 实时荧光PCR仪。 7.2 离心机：离心转速≥12000r/min。 7.3 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。 7.4 冰箱：2℃~8℃，-20℃ 7.5 高压灭菌器。 7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.7 pH计。 7.8 天平：感量10mg。 7.9 恒温水浴锅。 7.10 涡旋振荡仪。 2