SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4097—2015 贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法 Real-time fluorescent PCR quarantine protocol for Perkinsus sp.in shellfish 行业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-09-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4097—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张雪、肇慧君、李叶、李振荣、贾赞 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4097—2015 贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于贝类组织中派琴虫的检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR 在普通聚合酶链反应的基础上加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一 个报告荧光基团和一个率灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被萍灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5'-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可 接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形 成完全同步，达到实时定量的目的 3.2 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数，也可称为Cp值。 4 试剂和材料 服务平台 4.11mol/LTris·Cl(pH8.0)0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0）、SDS(10%）。溶液配制见附录A。 4.2 蛋白酶K溶液（20mg/mL）。 4.3 Tris-饱和酚。 4.4 三氯甲烷。 4.5 异戊醇。 4.6 无水乙醇。 4.7 生理盐水。 4.8 10XPCR buffer、25mmol/L MgClz、2.5 mmol/L dNTP,5 U/μL Taq 酶。 4.9 10μmol/L上游引物、10μmol/L下游引物、10μmol/L探针。 4.10 TE缓冲液(pH8.0)。 1 SN/T4097—2015 5仪器和设备 5.1丝 组织研磨器。 5.2电子天平。 5.3 3冷冻离心机。 5.4涡旋振荡器。 5.5水浴锅。 5.6超纯水机。 (0.08-0208~02)2 5.8高压灭菌锅。 5.9 9实时荧光PCR仪。 6检测步骤 6.1取样 选取濒死的新鲜贝类样品，或者有感染派琴虫临床症状的样品（消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收 缩，性腺发育受到抑制，生长迟缓等）。采集贝类的腮、套膜和消化腺等组织25mg，置于冰冷的生理盐 水中反复冲洗，用滤纸吸干表面水分，在液氮中冻5min，放至室温，再置于匀浆研磨器中并加人冷的生 理盐水50μL，进行手工匀浆研磨。 6.2DNA提取和纯化 6.2.1将匀浆液倒人1.5mL离心管中，加人生理盐水补充体积至200μL,加20μL蛋白酶K(20mg/mL)，再 加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。 6.2.2混合液置于55℃水浴锅内水浴2.5h 6.2.3向匀浆液中按1：1比例加人苯酚：三氯甲烷：异戊醇混合液（A.5），上下颠倒混匀，12000r/min 离心5min。 6.2.4转移上层水相，加人等体积三氯甲烷：异戊醇混合液（A.6），上下颠倒混匀，12000r/min离心 5 min。 6.2.5转移上层水相，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置30min或过夜。 6.2.612000r/min离心5min，沉淀DNA，倾去上清液 6.2.7于沉淀中加人75%乙醇溶液500μL，轻轻混勺后12.000r/min离心5min，倾去上清液，室温 晾干。 组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作 6.3 实时荧光PCR检测 6.3.1实时荧光PCR引物 该引物扩增派琴虫核糖体DNA序列中的ITS区域基因序列，扩增片度长度为69bp，参见附录B 下游引物：5'-CTTCGCTGCGTCCTTCATC-3 Taqman探针:5'-FAM-CGATGGATGCCTCGGCTCGAG-ECLIPSE-3 2