SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4828—2017 韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验 检测方法 Quarantine protocol for antibodies against Wesselsbrol disease virus by HI 行业标准信息服务平台 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4828—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘艳华、高志强、谷强、张伟、蒲静、乔彩霞、尹羿、汪琳、张利峰、凌凤俊 行业标准信息服务平台 1 SN/T4828—2017 韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验 检测方法 1范围 本标准规定了进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的血凝抑制试验检测方法。 本标准适用于进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的检测 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PBS: 磷酸盐缓冲盐水 HA: 血凝试验 HI: 血凝抑制试验 HAU: 血凝单位 3 设备、材料和试剂 3.1 设备 3.1.1 台式离心机。 3.1.2振荡器。 行业标准信 3.1.3 冰箱。 3.1.4恒温箱。 3.1.5 微量可调移液器。 3.2 材料和试剂 3.2.1 96孔V型微量反应板。 服务平台 3.2.2 含0.4%卵清蛋白的pH7.5PBS和含0.4%卵清蛋白的pH5.7PBS，配制方法见附录A。 3.2.3阿氏（Alsevers）液，配制方法见附录B的B.1。 3.2.40.5%鹅红细胞悬液，配制方法见B.2。 3.2.5韦塞尔斯布朗病血凝抗原，阳性血清和阴性血清。 3.3被检血清 无菌采集动物血液，凝固后离心分离血清，56℃灭活处理30min后，置于4℃或一20℃保存备用。 被检血清须采用高岭土-鹅红细胞吸附法去除非特异性凝集素。按如下方法进行处理：0.1mL被检血 清，加人0.4mLpH7.5磷酸盐缓冲液，再加人0.5mL25%高岭土，充分振荡混合，室温作用20min，然后 1000r/min离心30min取上清，加入25μL0.5%鹅红细胞悬液，轻轻振荡，冰浴吸附20min，1000r/min 离心10min，吸取上清，即为1：10稀释的被检血清。 1 SN/T 4828—2017 4操作步骤 4.11 血凝试验（见表1） 4.1.1 在微量反应板的每孔均加人25μL含0.4%卵清蛋白的pH7.5PBS。 4.1.2 吸取25μL韦塞尔斯布朗病血凝抗原加入第1孔，反复吹打混匀。 4.1.3 从第1孔吸取25μL液体加人第2孔，混匀后吸取25μL液体加人第3孔，如此对倍稀释至第 11孔，第11孔混匀后吸弃25μL。 4.1.4 每孔加人25μL含0.4%卵清蛋白的pH5.7PBS。 4.1.5每孔加人50μL0.5%鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。 4.1.6轻轻振荡混匀，在20℃～25℃下静置60min后观察结果。 4.1.7血凝效价确定：对照孔（第12孔）红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观察红细 胞有无呈泪珠状流尚，完全血凝（不流尚）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝效价，代表1个血凝单位 (HAU)。 4.1.8根据4.1.7的结果，使用含0.4%卵清蛋白的pH7.5PBS配制4HAU的病毒抗原，以完全血凝 的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。例如表2抗原效价 为24（1：16），4HAU抗原的稀释倍数为2（1：4）。 4.1.9将25L含4个血凝单位的抗原用PBS做等量倍比稀释，使每孔（25uL）含有2HAU、1HAU、 0.5HAU和0.25HAU，每孔补加25μLPBS，再加入50μL0.5%鹅红细胞悬液，判定血凝结果与预期结 果是否相符合。2HAU、1HAU孔红细胞应出现完全凝集，0.5HAU孔红细胞应出现50%凝集，0.25HAU 孔红细胞应不凝集。若不相符，应重新配制抗原，测定效价。 表1血凝试验 步骤 孔号 试验项目 对照 序号 5 6 8 LI 0.4%卵清蛋白的pH7.5 25 25 PBS/μL 2 抗原倍比稀释/uL 252 25 25 25 25 25 25 弃去 25 0.4%卵清蛋白的pH5.7 25 25 25 25 PBS/μL 25 0.5%鹅红细胞/uL 50 50 50 50 50 50 50 50 作用时间及温度条件 在20℃ 25℃下静置60min 判定举例 4.2 血凝抑制试验（见表2) 4.2.1 在微量反应板的每孔均加入25μL含0.4%卵清蛋白的pH5.7PBS。 4.2.2吸取25μL已经处理1：10稀释的被检血清加入第1孔内，充分混匀后吸取25μL于第2孔内， 4.2.3除空白对照孔外，每孔加人4HAU的抗原25μL，空白对照孔加人25μL含0.4%卵清蛋白的 pH5.7PBS,在20℃~25℃下静置60min。 4.2.4每孔加人50μL0.5%鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。 2