ICS 11.220 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5125—2019 水生动物副溶血弧菌和霍乱弧菌双重实时 荧光检测方法 Duplex real-time PCR for Vibrio Parahaemolyticus and Vibrio Cholerae 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5125—2019 前言 本标准根据GB/T1.1一2009的要求编写。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海海关，中国农业科学院上海兽医研究所。 本标准主要起草人：王艳、蒋蔚、黄忠荣、王权、熊炜、李健。 业标准信息服务平台 SN/T5125—2019 水生动物副溶而弧菌和霍乱弧菌双重实时 荧光检测方法 1范围 本标准规定了水生动物中副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重实时荧光PCR快速检验方法。 本标准适用于水生动物中副溶血弧菌和霍乱弧菌的快速检验 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 实时荧光定量PCR 实时荧光聚合酶链式反应 3.2Ct值 正式出版文本为 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。 准信息服务平台 3.3 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸。 3.4 bel Taq DNA 聚合酶。 3.5 V.Cholerae 霍乱弧菌。 3.6V.Parahaemolyticus 副溶血弧菌。 4 仪器与耗材 4.1全自动荧光定量PCR仪 1 SN/T5125—2019 4.2高速台式冷冻离心机。 4.3普通台式离心机。 4.4漩涡振荡器。 4.5均质器。 4.6 冰箱：4℃±1℃，-20℃±2℃。 4.7微量可调移液器及配套吸头。 4.8 31.5mLEppendorf管。 4.910mL离心管。 4.10灭菌样品处理器具：剪子、镊子。 4.11一次性手套。 4.12生物安全柜。 5主要试剂 除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。（见GB/T6682 5.13%氯化钠碱性蛋白陈水：见附录A中A.1。 5.2灭菌双蒸水。 6操作方法 6.1样品制备 版文本为港 6.1.1鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。 贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动 物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表 面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。 6.1.2以无菌操作取样品25g（mL），加人3%氯化钠碱性蛋白陈水225mL，用旋转刀片式均质器以 8000r/min均质1min，或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样 品放入无菌乳钵，自225mL3%氯化钠碱性蛋白陈水中取少量稀释液加人无菌乳钵，样品磨碎后放入 500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1-2次，洗液放人锥形瓶，最后将剩余稀释 液全部放人锥形瓶，充分振荡，制备1：10的样品匀液。（见GB4789.7） 6.2增菌培养 6.3模板DNA的提取 取1mL培养菌液于1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量弃去上清液，加人1ml 灭菌的双蒸水清洗1次后离心，同样尽量弃去上清液。加入100uL灭菌水充分混匀，进行沸水浴 注：可以采用等效商品化DNA提取试剂盒进行操作。 6.4双重荧光PCR检测 6.4.15 引物及探针序列 引物及探针序列见表1。 2