ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 34776—2017 T4 DNA连接酶 酶活及杂质检测方法 T4 DNA ligaseDetection methods of activity and impurities of enzyme 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34776—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶工作组（SAC/SWG11)归口。 本标准起草单位：中国测试技术研究院、深圳华因康基因科技有限公司、福建华灿制药有限公司。 本标准主要起草人：周李华、李怀平、盛司潼、孙登峰、谭辉彪、黄发灿、金虹、马丽侠、叶德萍、李花 王智、沈兴中、谭和平。 GB/T34776—2017 T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法 1范围 本标准规定了T4DNA连接酶的活力、杂质的检测方法 本标准适用于作为分子生物学研究用的T4DNA连接酶。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 YY/T0087电泳装置 YY/T0657医用离心机 JJG646移液器检定规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA连接酶 DNA ligase -种封闭DNA链上的缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化相邻的核苷酸分子间3'-羟 基和5-磷酸基形成磷酸二酯键。 注：DNA连接酶催化底物可以是DNA或RNA。依据酶的类型不同，反应中产生高能中间产物的辅助因子可以是 ATP或NAD+。 3.2 T4DNA连接酶T4DNAligase 一种T4噬菌体基因30的编码产物，以ATP作为辅助因子，催化双链DNA或RNA的5'-磷酸末 端和3-羟基末端形成磷酸二酯键。 DNA末端之间的连接，修复双链核酸中的单链切刻。 3.3 酶活力单位 unit activity 在20uL1XT4DNA连接酶反应缓冲液中，16℃反应条件下,30min能使50%的经HindⅢ消 化的入DNA片段[5'端浓度为0.12μmol/L（300μg/mL)］连接所需的酶量即为1活力单位 缩略语 4 下列缩略语适用于本文件。 PCR聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。 SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel 1 GB/T 34776—2017 electrophresis)。 Tris三（羟甲基）氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)metylaminomethane）。 5试剂与溶液 除非另有规定，本方法所用的试剂应为不含DNA和DNase的分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积 配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22um过滤器过滤除菌；酶缓冲液 应避免反复冻融；水为GB/T6682规定的一级水。 5.1氯化钠(NaCI)。 5.2琼脂粉（Agar)。 5.3氢氧化钠（NaOH)。 5.4乙二胺四乙酸二钠(NazEDTA，CioH4N,O.Naz)。 5.5TE缓冲液：10mmol/LTris-Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA，使用HCl或NaOH调节pH。 5.6酶贮存溶液：50mmol/LKCl，10mmol/LTris-Cl(pH7.4),0.1mmol/LEDTA,1mmol/L DTT,200μg/mLBSA和50%的甘油。 5mmol/LATP(pH7.8)。 于水中，定容至2L。 5.9 910X上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液。 6主要仪器和设备 6.1 电泳系统：应符合YY/T0087的要求。 6.2凝胶成像系统。 6.3加热制冷水浴/循环器：-20℃~100℃。 6.4冷冻离心机：可以在4℃下进行离心，离心转速10000r/min以上，应符合YY/T0657的要求。 6.5行 微量可调移液器：0.5pL～10μL，10uL100μL，100uL～1000L，应符合JJG646的要求。 7试验方法 7.1酉 酶活力测定 7.1.1入DNA-HindⅢ底物制备 入DNA-HindⅢ按照以下步骤进行制备： a）按表1配制酶切反应体系。加酶之前将反应混合物混匀（可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁， 切忌振荡混匀）；轻轻混匀，短暂离心。 表1酶切反应体系 试剂名称 加样体积 10X酶切缓冲液 40 μl 入 DNA(0.3 μg/μL) 60μL 2